本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了甘薯種薯及種苗的繁育規(guī)程，適用于河南省各甘薯種薯（苗）產(chǎn)地及栽培區(qū)。
2脫毒種薯（苗）的分級標(biāo)準(zhǔn)
2.1 高級脫毒試管苗
即經(jīng)過嚴(yán)格病毒檢測確認(rèn)不含有已知病毒或指定病毒，且經(jīng)過株系評選而中選的優(yōu)良試管苗以及用它離體快繁或防蚜蟲條件下速繁后得到的甘薯試管苗。
2.2原原種
即在防蚜蟲網(wǎng)棚內(nèi)無病原土壤上栽種高級脫毒試管苗生產(chǎn)的種薯。用原原種種薯在防蚜蟲條件下育出的薯苗叫原原種苗。
2.3原種
即利用原原種苗在具備500m以上隔離條件（即500m 內(nèi)沒有種植普通帶毒甘薯）而且土壤無病原的田塊生產(chǎn)的種薯。由原種在防蚜蟲條件下育出的薯苗叫原種苗。
2.4良種
即利用原種苗在普通無病留種田塊生產(chǎn)的種薯。良種育出的苗叫良種苗。
脫毒甘薯種薯分級指標(biāo)
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原原種 |
原種 |
良種 |
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繁殖田葉片病毒顯癥率不大于% |
目測法 |
0 |
0.1 |
1.0 |
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血清法 |
0.1 |
1.0 |
— |
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指示植物法 |
0.1 |
1.0 |
— |
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莖線蟲病攜帶率不大于% |
0 |
0 |
0 |
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根腐病攜帶率不大于% |
0 |
0 |
5.0 |
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黑斑病攜帶率不大于% |
0 |
0 |
5.0 |
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純度不低于% |
100 |
99.5 |
98.0 |
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薯塊整齊度不低于% |
85.0 |
85.0 |
85.0 |
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不完善薯塊不大于% |
1.0 |
1.0 |
3.0 |
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注：1.病毒檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)參見甘薯脫毒苗病毒檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)。
2.薯塊分級（純度、整齊度、不完整薯塊）按GB4406-84標(biāo)準(zhǔn)確定。薯塊整齊度是指重100～250g的薯塊占總量的百分比；不完整薯塊系指機(jī)械損傷、蟲鼠咬傷、自然干裂或嚴(yán)重畸形的薯塊所占總塊數(shù)的百分比。
3脫毒甘薯種薯（苗）生產(chǎn)技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)
3.1高級脫毒試管苗生產(chǎn)
3.1.1脫毒莖尖苗培育
選具有本品種特征特性的無病甘薯苗莖頂部3cm長的芽段，用70%酒精、3%漂白粉液分別消毒，在超凈工作臺內(nèi)解剖鏡下剝離莖尖。將剝離的長約0.2～0.5mm（一般帶1～2個葉原基）的莖尖接種在附加1～2mg/l 6-BA的MS培養(yǎng)基上，26～28℃下光培養(yǎng)，莖尖膨大變綠后轉(zhuǎn)入無激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)成莖尖試管苗。待苗長至5～6片葉時移至營養(yǎng)缽內(nèi)進(jìn)行病毒檢測。
脫毒莖尖苗是指莖尖分生組織培養(yǎng)得到的不含有已知病毒或指定病毒的莖尖苗。必須經(jīng)過本規(guī)程中有關(guān)方法及程序進(jìn)行病毒檢測，從中篩選出脫毒莖尖苗。
3.1.2高級脫毒試管苗繁育
經(jīng)病毒檢測確認(rèn)的脫毒苗必須進(jìn)行優(yōu)良株系評選，淘汰變異株系，保留優(yōu)良株系。株系評選的方法是：將脫毒苗株系切段快繁成10株以上，每系取5～10株栽種到防蟲網(wǎng)室內(nèi)，以同品種普通帶毒薯為對照，進(jìn)行形態(tài)、長勢、產(chǎn)量等多方面的觀察評定，選出若干既符合品種特性又高產(chǎn)的最優(yōu)株系，混合繁殖成原原種。與最優(yōu)株系相同來源的脫毒試管苗混合快繁，即為高級脫毒試管苗。
高級脫毒試管苗離體切段快繁：將待繁的高級脫毒試管苗在無菌條件下切成一葉一節(jié)的切段，扦插在無激素的MS培養(yǎng)基上，在26～28℃， 14～16h光照條件下離體培養(yǎng)，25～30d左右即可長成5～7片葉大小的幼苗，可以進(jìn)入下一輪切段快繁。
3.2原原種繁育
脫毒甘薯原原種的繁育必須具備3方面的條件。第一，栽種的苗必須是高級脫毒試管苗。第二，必須要在防蟲網(wǎng)棚內(nèi)生產(chǎn)原原種。防蟲網(wǎng)棚是繁育原原種的重要條件之一，而且所用防蟲網(wǎng)的網(wǎng)眼必須在40目以上，這樣蚜蟲就不能通過，可以大大減少蚜蟲傳播病毒的機(jī)會。第三，所用地塊必須是無病原土壤，最好選用多年未栽種過甘薯的土壤。
在繁殖原原種時，要始終貫穿防止病毒再侵染的意識。在網(wǎng)棚內(nèi)每隔5～10米種植一些指示植物，每隔15天噴灑一次殺蟲藥劑，防治蚜蟲，以防蚜蟲傳毒。防蚜蟲時最好多種藥劑輪換使用，以免蚜蟲產(chǎn)生抗藥性，達(dá)不到防治效果。
原原種生產(chǎn)過程中要定期逐株觀察是否有病毒癥狀，一旦發(fā)現(xiàn)病株要堅決拔除。如果網(wǎng)棚內(nèi)所種植的指示植物表現(xiàn)病毒癥狀，整個棚內(nèi)所繁殖的種薯應(yīng)降級使用。
3.3原種繁育
原種的繁殖必須具備（1）所用薯苗為原原種苗；（2）具有500m內(nèi)無普通帶毒甘薯種植的空間隔離條件；（3）所用田塊至少3年以上沒種過普通帶毒甘薯，且為無莖線蟲病、根腐病、黑斑病等的無病田。
原種繁殖時要密切注意防止病毒再侵染。要在繁殖田內(nèi)每隔15～20米種植一些指示植物，每15d定期噴灑防蚜蟲藥劑，以防蚜蟲傳毒。收獲前要觀察病毒發(fā)病情況，及時拔去病株。收獲時嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，不符合質(zhì)量要求的薯塊堅決不入窖。
3.4良種繁育
良種繁育必須具備條件：（1）必須用原種苗進(jìn)行繁育；（2）所用田塊應(yīng)為無病留種田，無莖線蟲病、根腐病、黑斑病等。
各級種薯生產(chǎn)的要求和主要措施
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項 目 |
高級脫毒 試管苗 |
原原種 |
原種 |
良種 |
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選場選擇 |
繁育場地 |
組織培養(yǎng)室 |
防蟲網(wǎng)棚 |
無病留種田 |
無病留種田 |
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留種面積 |
占大田栽培面積0.001% |
占大田栽培面積0.1% |
占大田栽培面積5% |
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場地要求 |
地勢高燥，土壤較肥，最少5年以內(nèi)未種過普通甘薯，無莖線蟲病、根腐病、黑斑病等病原 |
地勢高燥，土壤較肥，最少3年以內(nèi)未種過普通甘薯，無莖線蟲病、根腐病、黑斑病等病原 |
地勢高燥，土壤較肥，無莖線蟲病、根腐病、黑斑病等病原 |
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灌溉條件 |
有 |
有 |
有 |
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脫毒薯種（苗） 來源 |
莖尖培養(yǎng)得到的脫毒苗 |
高級脫毒試管苗 |
原原種苗 |
原種苗 |
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防病毒條件 |
隔離條件 |
用40目防蟲網(wǎng)隔離 |
與普通甘薯隔開500米以上 |
與普通甘薯田塊隔開 |
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治蟲 |
每15天噴藥治蚜1次，最少噴8次 |
每15天噴藥治蚜1次，最少噴6次 |
每15天噴藥治蚜1次,最少噴6次 |
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拔除病雜株 |
4次 |
2次 |
1次 |
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淘汰病雜薯 |
1次 |
1次 |
1次 |
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指示植物 |
每隔5～10米種1株巴西牽牛 |
每隔15～20米種1株巴西牽牛 |
無 |
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培措施 |
育苗方式 |
加溫多級育苗、采苗圃繁苗 |
加溫多級育苗、采苗圃繁苗 |
陽畦及加溫育苗、采苗圃繁苗 |
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密度 |
3000～4000株/666.7m2 |
3000～3500株/666.7m2 |
3000～3500株/666.7m2 |
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栽種時間 |
夏薯 |
夏薯 |
夏薯 |
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施肥 |
N、P、K高肥地按1：1：2施用，中肥地按1：1：1施用 |
N、P、K高肥地按1：1：2施用，中肥地按1：1：1施用 |
N、P、K高肥地按1：1：2施用，中肥地按1：1：1施用 |
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田間管理 |
抗旱排澇，控制旺長 |
抗旱排澇，控制旺長 |
抗旱排澇，控制旺長 |
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收獲期 |
正常偏早 |
正常偏早 |
正常偏早 |
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儲藏 |
10～13℃ |
10～13℃ |
10～13℃ |
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種薯藥劑處理 |
50%甲基托布津或50%多菌靈500倍或90%甲基托布津800倍浸種10分鐘 |
50%甲基托布津或50%多菌靈500倍或90%甲基托布津800倍浸種10分鐘 |
50%甲基托布津或50%多菌靈500倍或90%甲基托布津800倍浸種10分鐘 |
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4脫毒苗的病毒檢測方法與標(biāo)準(zhǔn)
4.1脫毒苗的病毒檢測方法
4.1.1目測法
目測法是根據(jù)甘薯葉片和薯塊上出現(xiàn)的典型癥狀判斷甘薯是否感染病毒。甘薯病毒病的癥狀主要包括：（1）葉斑型。主要有紫色羽狀斑、紫斑、紫環(huán)斑、黃色斑或者枯斑（2）花葉型。苗期感病后，初期葉脈呈網(wǎng)狀透明，后沿葉脈出現(xiàn)不規(guī)則黃綠相間的花葉斑紋（3）卷葉型。葉片邊緣上卷，嚴(yán)重者可形成杯狀（4）葉片皺縮型。病苗葉片較小，皺縮，葉緣不整齊，甚至扭曲畸形（5）葉片黃化型。包括葉片黃化及網(wǎng)狀黃脈。薯塊上的癥狀主要是產(chǎn)生黑褐色或黃褐色龜裂紋。
病毒病的癥狀可因病毒種類、甘薯品種以及環(huán)境條件等因素的影響而改變，因此根據(jù)癥狀只能作初步判斷。另外，目測法還應(yīng)注意區(qū)分甘薯品種特性以及由于土壤水份對大、營養(yǎng)失調(diào)等原因造成的生理病害與病毒病癥狀的差異。
4.1.2指示植物法
常用巴西牽牛(Ipomoea setosa)作指示植物，幾乎所有侵染甘薯的病毒都能感染巴西牽牛，因此，將薯苗嫁接在巴西牽牛上，從巴西牽牛的顯癥情況可判斷薯苗是否帶毒。具體嫁接方法如下：以薯苗芽尖作接穗，將芽尖削成楔形，另將具3-4片真葉的巴西牽牛作砧木，在其莖中部切一斜口把楔形接穗插入，用封口膜扎住，置防蟲網(wǎng)室內(nèi)遮陰保濕3-4天，然后在自然光照下觀察記載牽牛的顯癥情況，一般嫁接后25～30天左右開始出現(xiàn)癥狀,顯癥初期新生葉出現(xiàn)系統(tǒng)性明脈，以后發(fā)展為花葉或皺縮等癥狀。
4.1.3甘薯病毒的血清學(xué)檢測
常用的血清學(xué)檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）或在此基礎(chǔ)上改進(jìn)的斑點酶聯(lián)免疫吸附法（Dot-Blot ELISA）等。Dot-Blot ELISA具有快速和能檢測大量樣品的特點，在大量檢測樣品時較常應(yīng)用。具體檢測方法如下：
(1)樣品處理：取直徑約為1cm的樣品葉片（約0.1g），加入1ml抽提緩沖液，迅速研磨，置小離心管中，取上清液供檢測用。
(2)點樣：將NC膜在TBS(20mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, )中充分濕潤，然后放在一張干燥濾紙上，讓其稍事干燥，用鉛筆作好記號，用微量取樣器進(jìn)行點樣，點樣后讓NC膜自然干燥。
(3)反應(yīng):
（a）封閉: 將點樣后的NC膜轉(zhuǎn)入封閉液(TBST+5%脫脂奶粉)中封閉1小時或4℃封閉過夜。
(b) 第一抗體反應(yīng): 封閉后的NC膜用TBST(20mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20)漂洗2-3次, 每次5-10分鐘, 加入用TBST稀釋的病毒專化抗血清(1:2000) 37℃保溫1小時, 再用TBST洗膜3次, 每次5-10分鐘。
(c) 第二抗體反應(yīng): 加入TBST稀釋的堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1:5000), 37℃保溫1小時, 再用TBST洗膜3次, 每次5-10分鐘。
(d) 顯色: 避光條件下, 將NC膜置于含330μg/ml NBT和165μg/ml BCIP的堿性磷酸酯酶緩沖液(100mM Tris-HCl, pH9.5, 100mM NaCl, 5mM MgCL2)中顯色至樣點清晰, 將膜放入蒸餾水中漂洗, 終止顯色反應(yīng)。取出晾干, 拍照。
4.1.4分子生物學(xué)方法檢測
近年來，隨著分子病毒學(xué)的發(fā)展，一些甘薯病毒（例如SPFMV、SPLV等）的核苷酸序列已經(jīng)清楚，根據(jù)已知的核酸序列，設(shè)計特異引物，利用RT-PCR可快速檢測甘薯病毒和病毒的不同株系。也可利用核酸探針，通過核酸雜交的方法檢測病毒的存在。
4.2 不同級別脫毒苗的檢測
由于甘薯脫毒苗在繁育過程中極易受到病毒的再侵染，因此，在繁種過程中，除根據(jù)不同級別種薯的繁種要求采取防治蚜蟲等必要措施外，還應(yīng)加強(qiáng)病毒的檢測，及時淘汰感病種薯以保證脫毒種薯的質(zhì)量。根據(jù)不同級別種薯對病毒感染率的要求，可采取不同的病毒檢測方法。
4.2.1 莖尖苗的檢測
莖尖苗的檢測可首先采取目測法。由于脫毒莖尖苗和帶毒莖尖苗在形態(tài)、長勢上有明顯差異，前者生長快、葉片平展、植株較健壯；后者長勢弱，葉片上常出現(xiàn)花葉、明脈和褪綠斑等癥狀，因此，可先用目測法淘汰弱苗和顯癥苗。然后再用血清學(xué)方法或分子生物學(xué)方法進(jìn)行篩選，經(jīng)血清學(xué)或分子生物學(xué)方法檢測呈陰性的樣品再進(jìn)行嫁接。每個莖尖苗一般嫁接3-5株，有1株發(fā)病即認(rèn)為該樣帶毒，對于都不發(fā)病的樣品應(yīng)再重復(fù)嫁接1次。
4.2.2 原原種田的檢測
脫毒原原種的繁殖一般在防蟲網(wǎng)室內(nèi)進(jìn)行，原原種田病毒的檢測方法是：首先在原原種田種植若干株巴西牽牛，定期觀察巴西牽牛是否顯癥、以判斷是否有蚜蟲傳毒；對原原種田還要進(jìn)行定期普查，及時淘汰顯癥株和變異株；另外對原原種田要定期取樣，用血清學(xué)方法或嫁接指示植物的方法進(jìn)行檢測，以判斷原原種田病毒的感染情況，對于病毒感染率超標(biāo)的繁種田要降級使用。
4.2.3 原種田的檢測
脫毒原種的繁殖要在有一定隔離區(qū)的地方進(jìn)行，即周圍500米內(nèi)不能種植非脫毒薯。原種田的病毒檢測以目測法和田間種植巴西牽牛為主，必要時田間取樣用血清學(xué)方法檢測病毒的感染率。
4.2.4 良種田的檢測
良種田的病毒檢測以目測法為主，就是要定期對良種田的發(fā)病率進(jìn)行調(diào)查，必要時也可抽樣用血清學(xué)方法檢測，當(dāng)發(fā)病率超過一定標(biāo)準(zhǔn)時就不能再作為種薯使用。
4.2.5不同級別脫毒苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
根據(jù)不同級別脫毒苗對病毒感染率的不同要求，初步制定以下判斷標(biāo)準(zhǔn)，病毒感染率超過一定標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)降級使用。
甘薯脫毒苗病毒檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)（試行）
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種苗級別 |
取樣方法 |
檢樣數(shù)量 |
重復(fù)次數(shù) |
判斷依據(jù) |
檢測標(biāo)準(zhǔn) |
備注 |
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試管苗 |
a.血清法 b.指示植物法 |
試管苗 |
3株/株系 |
2 |
a.血清學(xué)檢測陰性 b.嫁接所有重復(fù)均不顯癥 |
顯癥率為0 |
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原原種苗 |
a.目測法 b.血清法 c.指示植物法 |
5點樣方取樣 |
目測普查 50株/畝 100株/畝 |
2 |
嫁接不顯癥或血清反應(yīng)陰性 |
目測顯癥率為0；血清及指示植物陽性率小于0.1%. |
目測顯癥率大于0.1%者可降級為原種使用。 |
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原種苗 |
a.目測法 b.血清法 c.指示植物法 |
5點樣方取樣 |
多點普查 100株/畝 50株/畝 |
2 |
同上 |
目測顯癥率小于0.1%；血清及指示植物陽性率小于1%. |
顯癥率大于1%者可降級為良種使用。 |
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良種苗 |
a.目測法 b.血清法 |
隨機(jī)多點取樣 |
100株/點 |
3-5 |
依癥狀判斷 |
目測顯癥率小于1%. |
5脫毒甘薯繁育供種體系
脫毒甘薯的繁育體系是指經(jīng)省（市、區(qū)、縣）有關(guān)部門核準(zhǔn)，由不同單位組成的完成的脫毒甘薯、馬鈴薯種薯及種苗生產(chǎn)的各層次、各環(huán)節(jié)任務(wù)的組織整體。
良種利用2年后增產(chǎn)效果就不再明顯，需要每2年更換一次新脫毒薯種。因此，必須根據(jù)當(dāng)?shù)厣a(chǎn)和經(jīng)濟(jì)條件，建立起脫毒甘薯繁育與供應(yīng)體系，以源源不斷地為生產(chǎn)提供優(yōu)良脫毒薯種，確保脫毒甘薯增產(chǎn)潛力的最大發(fā)揮。各級繁育供應(yīng)體系的設(shè)置及職責(zé)如下圖所示。
脫毒甘薯繁育、供應(yīng)體系示意圖
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繁育供種體系 |
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職責(zé)范圍 |
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省級脫毒與檢測中心 |
→ |
1.篩選品種 2.莖尖組織培養(yǎng)誘導(dǎo)莖尖苗 3.病毒檢測與種苗質(zhì)量鑒定 4.優(yōu)良脫毒莖尖苗株系的篩選 5.高級脫毒試管苗速繁與供應(yīng) 6.原原種繁殖與供應(yīng) 7.技術(shù)培訓(xùn)與指導(dǎo) |
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市（縣）級種薯繁育基地 |
→ |
1. 設(shè)置防蟲溫網(wǎng)室，建立原原種繁殖基地 2. 引進(jìn)高級脫毒苗快繁 3. 原原種、原種生產(chǎn)、貯存與供應(yīng) 4. 原種病毒檢測與質(zhì)量監(jiān)督 5.技術(shù)培訓(xùn)、指導(dǎo) |
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縣（鄉(xiāng)）級種薯供應(yīng)基地 |
→ |
1. 設(shè)置隔離區(qū)，建立原種繁殖基地 2. 引進(jìn)原原種育苗、速繁 3. 原種、良種生產(chǎn)和供應(yīng) 4.良種種薯管理與質(zhì)量監(jiān)督 5.技術(shù)指導(dǎo)、培訓(xùn) |
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鄉(xiāng)（村）級種薯供應(yīng)基地 |
→ |
1. 選擇無病留種田，建立良種基地 2. 良種生產(chǎn)、供應(yīng) 3. 脫毒甘薯栽培技術(shù)指導(dǎo) |
